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LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8

发布时间:2022-06-17 点击量:239

Cell Counting Kit-8

Catalog Number:P11110


01/产品概述


LeapWal Cell Counting Kit-8,简称CCK-8或CCK8试剂盒,是一种基于WST-8(水溶性四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒,是MTT、XTT、MTS等的优良替代方法。


WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan (图1) 。对于相同起始量的细胞,细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同种细胞,颜色的深浅 (生成的formazan量) 与细胞数目呈线性关系 (图3) 。


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图1. WST-8检测原理图(EC=electron coupling reagent,即电子耦合试剂)


WST-8是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有以下明显的优点:(1) MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶液来溶解,而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤,WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。(2) WST-8比XTT、MTS更加稳定,使实验结果更加可靠。(3) WST-8和MTT、XTT等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。


LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8为即用型试剂,使用方法十分便捷,无须再进行任何配制等操作,无须使用同位素,所有的检测步骤仅在同一块96孔板内即可完成。不必洗涤细胞,不必收集细胞,也不必采用额外的步骤溶解formazan,可以用于大批量样品的检测。同时,WST-8对细胞无明显毒性,加入CCK-8溶液显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,便于找到最佳测定时间。LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8可以应用于细胞增殖和细胞生长抑制检测、毒性测定、药物筛选、肿瘤药敏等试验。



02/产品组分

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03/保存条件


冰袋(wet ice)运输。4℃避光保存,有效期12个月。-20℃避光保存,有效期24个月。



04/产品特点

即用型试剂,无须再进行任何试剂的配制

对细胞无明显毒性,检测时间更加灵活,可在不同时间点反复/连续读值

显色稳定,使实验结果更加可靠

线性范围宽,灵敏度高

可用于大批量样品的检测



05/实验流程概要

cck8 画图_01.png



06/实验步骤


一. 制作标准曲线(使用此标准曲线的前提条件是试验条件*一致)

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液的细胞数量,然后接种细胞;

2.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般需要做5-7个细胞浓度梯度,每组4-6 个复孔;

3. 接种后培养4-6小时使细胞贴壁(悬浮细胞可省略此步骤);

4. 加入LeapWal Cell Counting Kit-8试剂(每100μL培养基加10μL CCK-8)。培养一定时间(0.5-4小时)后测定OD450,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD450为纵坐标的标准曲线,根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。


二. 细胞活性检测

1. 在 96 孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养16-24小时;

2. 向每孔中加入10μL CCK-8溶液,切勿产生气泡,气泡会影响OD值的读数;

3. 将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时;

4. 用酶标仪测定450nm处的吸光度。


三. 细胞增殖-毒性检测

1. 在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养16-24小时;

2. 向培养板加入不同浓度的待测药物(依据实验者具体方案而定);

3. 将培养板置于培养箱内孵育一段时间(依据实验者具体方案而定);

4. 向每孔加入10μL CCK-8溶液,切勿产生气泡,气泡会影响OD值的读数;

5. 将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时;

6. 用酶标仪测定450nm处的吸光度。

Ø 如果待测物质有氧化性或还原性,可在加入CCK-8之前,弃去旧培养基,用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基,来去除药物的影响。当药物影响较小时,也可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白对照孔的吸光度值即可。



07/计算公式


细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)

Ac: 对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液,不含药物)

Ab: 空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液,不含细胞、药物)



08/适用范围


1. 细胞增殖测定:CCK-8是水溶性的,在培养基中稳定且无毒。

2. 细胞活性和细胞毒性分析:代谢活性以及染料的形成与细胞的活性和损伤成比例。

3. 细胞因子分析:测定细胞因子诱导的增殖,必要时,可在试验结束时回收和扩增细胞。



09/注意事项


1. 使用96孔板进行检测时,需考虑液体蒸发问题。由于96孔板周围一圈最容易蒸发,建议弃用周围一圈,改加等量的PBS、水或培养液。

2. 细胞增殖实验建议每孔加入100μL 2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100μL 5000个细胞(具体每孔所用的细胞数目,需根据细胞大小、细胞增殖速度等因素决定)。按照实验需要进行培养并给予0-10μL 特定的药物刺激。

3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,还原剂(例如,抗氧化剂)会干扰检测结果,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。

4. 测试药物如含有金属,对CCK-8显色会有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%,15%,90%的显色反应,使灵敏度降低。如果终浓度是10mM,将会100%抑制,需设法去除。

5. 培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

6. 检测时,如果起始培养体积为100μL,每孔加入10μL CCK-8溶液。如果起始培养体积为200μL,则需加入20μL CCK-8溶液,其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测,需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

7. CCK-8的培养时间一般为0.5-4小时,对于大多数情况孵育1小时即可。孵育时间的长短需根据细胞类型和细胞密度等实验情况而定,需要摸索条件,初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的时间点用于后续实验。

8. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片,可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长,例如650nm,作为参考波长进行双波长测定。

9. 酶标仪检测前需确保孔内没有气泡,否则会干扰测定结果。

10. 需要测定细胞的具体数量时,建议同时做标准曲线。

11. 若检测样本较多,建议采用多通道移液器,以减小工作量及平行孔间的差异。

12. 以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板): (a)显色反应后,将培养板放置于4℃冰箱内。(b)每孔加入10μL 0.1M HCl溶液。(c)每孔加入10μL 1% (w/v) SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。注意:反应停止后,应在24小时内测定。

13. 为了您的健康安全,请规范操作,穿戴实验服与手套开展实验。

14. 本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及治疗。



10/实验案例分析


1. 将不同数量的HeLa细胞按照每孔100μL 培养液接种于96孔板中,培养24小时后细胞充分贴壁,每孔加入10μL CCK-8溶液。

2. 孵育1小时后测定450nm的吸光度值,检测结果如图3所示。(检测结果仅供参考,实测数据会因检测仪器等的不同而存在差异)


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图3: CCK-8 试剂盒检测细胞活性



11/其他相关产品

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