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ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit LP110

发布时间:2022-06-18 点击量:440

ViralStarsTM LP

Lentivirus Packaging Kit

Catalog Number:LP110



01/产品概述


慢病毒是一种有包膜的RNA病毒,直径为80-120 nm,呈二十面体对称结构、球形。病毒颗粒最外层是包膜(包膜蛋白决定了感染细胞的类型),再往里依次为基质蛋白和衣壳,最里面是两条相同的正股RNA链和酶(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)。


慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供包装重组慢病毒载体所需的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接或浓缩后用于宿主细胞的感染。


慢病毒感染细胞的第一步是通过包膜蛋白与细胞表面受体结合。慢病毒与宿主细胞膜融合后释放结构蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆转录酶的作用下逆转录并与整合酶形成整合前复合物。整合前复合物进入细胞核后,整合酶催化其整合至宿主基因组。整合后的DNA转录为mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白或产生RNAi干扰。


ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包装试剂盒属于第二代慢病毒包装体系,同时可兼容第二代和第三代慢病毒包装质粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒,即产生的慢病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit包装的慢病毒具有感染效率高、感染谱广等特点,可实现外源基因在宿主细胞中的稳定持续表达。经该试剂盒包装获得的对照质粒病毒滴度可达108 TU/mL。


ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包装试剂盒包含如下组分:

(1) 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物(Package Plasmid Mix),经过设计调整,可兼容大多数慢病毒表达载体,确保将重组子包装成具有高感染率的慢病毒颗粒。

(2) 表达GFP 和 Puro标记的对照质粒(Control Plasmid),便于观察病毒包装效率及测定病毒滴度。

(3) 高效转染试剂(PolyShooter Transfection Reagent),具有更高的转染效率和更低的细胞毒性。

(4) 常用病毒感染增强试剂Polybrene,能够显著提高病毒与细胞的接触及感染效率。



02/产品组分

截屏2022-06-18 12.29.01.png



03/保存条件


冰袋(wet ice)运输。-20℃ 保存,有效期12 个月。



04/产品特点


* 简单快速——操作简单,无需对包装辅助质粒进行抽提,也无需对包装体系进行优化

* 病毒滴度高——可包装出高滴度、高表达水平的慢病毒

* 应用范围广——经过设计及优化配比,兼容大多数慢病毒表达载体



05/实验流程概要

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06/实验步骤


一、重组慢病毒制备

1. 细胞准备

转染前一天,将4-6×106 个293T细胞接种到10 cm细胞培养皿中,使其在包装时密度为70%-80%,放置于37℃,5% CO2培养箱培养16 h~24 h。

Ø 细胞状态会极大影响病毒包装效率,待包装细胞应处于良好生长状态,建议使用生长处于指数期、存活率大于90% 的细胞进行慢病毒包装。

Ø 该包装系统与ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001)配合使用,可包装出更高滴度、更高表达水平的慢病毒。

2. 慢病毒包装

(1) 取10 μL慢病毒包装辅助质粒混合物(Package Plasmid Mix)加入到2 mL离心管中,加入2.5 μg含有目的基因的慢病毒载体质粒,轻轻混合,加入32 μL PolyShooter 转染试剂与质粒混合,室温孵育3分钟。

Ø 慢病毒载体质粒需根据研究基因自行构建,应使用无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒提取,保证质粒A260/A280比值为1.8-2.0,浓度不低于500 ng/μL。溶解后的质粒切忌反复冻融,需按照使用量进行分装并于-20℃保存。

(2) 往上述混合物中加入1.8 mL无血清无双抗的DMEM基础培养基,轻轻混匀,在室温下静置30分钟,形成转染试剂-核酸复合物。

Ø 转染试剂-核酸复合物在室温下4个小时内保持稳定。

(3) 将上述1.8 mL转染试剂-核酸复合物轻轻地逐滴均匀加入10 cm皿293T细胞中,轻轻摇动培养皿混匀,置于37℃,5% CO2培养箱中培养产毒。

3. 收获病毒

(1) 转染24 h后,可选择弃去初始病毒上清液,加入10-15 mL新鲜的*培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中,置于37℃,5% CO2培养箱继续培养(此步骤可选)。

(2) 转染48 h后,收集病毒上清液,再加入10-15 mL新鲜的*培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中,置于37℃,5% CO2培养箱继续培养。

(3) 转染72 h后,观察细胞状态并拍照,进行二次病毒上清液收集,与48 h收集的上清液混合,300xg离心10分钟以除去细胞碎片,使用0.22 μm滤器过滤,过滤后的上清液可直接感染目的细胞,或使用慢病毒浓缩试剂盒(LC110R)浓缩后感染目的细胞。

Ø 切忌反复冻融病毒,冻融一次病毒滴度将降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年内使用。


二、病毒滴度测定

1. 孔稀释法标定带荧光的重组慢病毒滴度

(1) Day1:准备细胞

对生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至
1-3x105个
/mL
,加入96孔板,100
μL/孔(1-3x104个
/孔),每⼀种慢病毒设6个梯度孔,置于37℃,5% CO2培养箱中培养。

(2) Day2:病毒的稀释与感染

在EP管中做10倍梯度稀释,连续6个稀释梯度。稀释方法如下:准备6个⽆菌EP管,每个EP管中加⼊90μL 新鲜的*培养基(含10 μg/mL polybrene),取待测定病毒液10 μL加⼊到第⼀个EP管中(标记10 μL),混匀后取10 μL病毒稀释液加⼊到第⼆个EP管中(标记1 μL),以此类推,直到稀释到最后⼀管。弃去96孔板中原有的培养基,将稀释好的病毒依次加入孔中,并做好标记,⼩⼼操作,不要吹起细胞,置于培养箱中培养16 h。如需设置复孔,则按复孔的数量倍数增加以上用量。


4.png


(3) Day3:弃病毒,换液

吸去含病毒的培养基,在每个孔中再加入
100 μL
预热的新鲜*培养基。

(4) Day4:荧光计数与滴度计算

方法1:末位稀释计数法

感染36-48 h后,用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两孔的荧光细胞数(若设置了复孔,则计算复孔内的总数之和并计算出平均数),假设为A(倒数第二孔的

荧光细胞数)和B(倒数第一孔的荧光细胞数)。

慢病毒滴度计算公式1:病毒滴度 (TU/mL) =(A+B×10)×1000/2/A孔病毒量(μL)

举例1:5号管对应的荧光阳性细胞数为10个,6号管对应的荧光阳性细胞数为2个,则病毒滴度为:

滴度(TU/mL)=
(
10+2x10)x1000/2/0.001
=
1.5x107

如果需要感染
2x105个细胞,MOI=5(1个细胞对应5个病毒颗粒),则需病毒体积为:

所需病毒体积
=
2
x105x
5/1.5x107(mL)=
0.067
mL
=
67
μL

方法2:适量荧光计数法

感染36-48 h后,用荧光显微镜或流式细胞术对荧光比例合适(10%-50%)的连续两个梯度进行统计,数出两孔的荧光细胞数(若设置了复孔,则计算复孔内的总数之和并计算出平均数),假设为 C(较高浓度孔的荧光细胞数)和D(较低浓度孔的荧光细胞数)。

慢病毒滴度计算公式2:病毒滴度 (TU/mL) =(C+D×10)×1000/2/C孔病毒量(μL)

举例2:3号管对应的荧光阳性细胞数为10000个,4号管对应的荧光阳性细胞数为2000个,则病毒滴度为:

滴度(TU/mL)=
(
10000+2000x10)x1000/2/0.1
=
1.5x108

如果需要感染
2x105个细胞,MOI=30(1个细胞对应30个病毒颗粒),则需病毒体积为:

所需病毒体积
=
2
x105x
30/1.5x108(mL)=
0.04
mL
=
40
μL

2. 相对定量PCR标定非荧光的重组慢病毒滴度

(1) Day1:准备细胞

对生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1-3x105个
/mL
,加入24孔板,500
μL/孔(
0.5-1.5x105个
/孔),每⼀种慢病毒设6个梯度孔,置于37℃,5% CO2培养箱中培养。

(2) Day2:病毒的稀释与感染

在EP管中做10倍梯度稀释,连续6个稀释梯度。稀释方法如下:准备6个⽆菌EP管,每个EP管中加⼊450μL 新鲜的*培养基(含10 μg/mL polybrene),取待测定病毒液50 μL加⼊到第⼀个EP管中(标记50 μL),混匀后取50 μL病毒稀释液加⼊到第⼆个EP管中(标记5 μL),以此类推,直到稀释到最后⼀管。弃去24孔板中原有的培养基,将稀释好的病毒依次加入孔中,并做好标记,⼩⼼操作,不要吹起细胞,置于培养箱中培养16 h。如需设置复孔,则按复孔的数量倍数增加以上用量。

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(3) Day3:弃病毒,换液

吸去含病毒的培养基,在每个孔中再加入
500 μL
预热的新鲜*培养基。

(4) Day4:相对定量PCR与滴度计算

用PBS清洗并将细胞吹打下来,离心收集细胞,进行基因组DNA的提取,qPCR检测。以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品,慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数。以Actin质粒梯度稀释为标准品,Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数。

慢病毒滴度计算公式3:滴度(IU/mL)=(E×N×1000)/对应孔病毒量(μL),其中E=平均每基因组慢病毒整合拷贝数,N=感染时细胞的数目(约为1.5×105)。

Ø 测定时,设置一组带荧光的已知TU的慢病毒作为对照,以校验检测出的数值。


三、慢病毒感染目的细胞

VSVG包膜蛋白对不同的细胞和组织的亲嗜性有很大差异,在使用慢病毒感染目的细胞之前,需要查阅相关文献或进行预实验确定目的细胞的复感染指数(MOI,multiplicity of infection)。

1. 按照上述步骤包装慢病毒及确定慢病毒滴度,通过病毒滴度和MOI计算所需病毒量(计算公式参考06/实验步骤/病毒滴度测定)。

2. 实验前一天,将生长状态良好的目的细胞消化计数后稀释至1-3×105/mL,加入12孔板,1 mL/孔。放入37℃,5% CO2培养箱中培养。

Ø 悬浮细胞不需要提前一天接种,实验前将细胞计数接种后,直接加入病毒混合液即可。

3. 配制慢病毒+polybrene+培养基混合液。polybrene为常用的促感染试剂,能够显著提高病毒与细胞的接触及感染效率,一般使用浓度为2-10 μg/mL,但对某些细胞(如末端分化的神经元,DC细胞等)毒性较大,初次使用建议先做毒性测试。

4. 吸去12孔板中目的细胞的培养基,加入3中配制的慢病毒混合液,放入37℃,5% CO2 培养箱中继续培养。

Ø 感染悬浮细胞或半悬浮细胞,则需采用平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养板后,封好口,放入平角离心机中,低速(200xg)离心
1 h
,然后放入培养箱中继续培养。

Ø 若实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替,将细胞吸入离心管中,进行低速离心,去掉大部分上清,加入适量的病毒液,室温放置
15 min,然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养板中继续培养。

5. 病毒感染16 h后更换为新鲜培养基继续培养。

6. 病毒感染36-48 h后,荧光显微镜下观察荧光表达情况。

7. 若表达效果不理想,可调整MOI(例如,设置MOI梯度)再次检测。



07/适用范围


兼容大多数慢病毒表达载体,经过设计及优化配比,确保将重组子包装成具有高感染率的慢病毒颗粒,同时防止病毒的自我复制。



08/注意事项


1. 该系统与ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001)配合使用,可包装出更高滴度、更高表达水平的慢病毒。

2. 在收获粗病毒后,建议额外分装几支20-100 µL小体积管,和其他分装的大体积病毒一并置于-80℃保存。待这些小体积病毒结冰后,取出来融化,再测定滴度。这一步可以模拟一次冻融带来的活性滴度下降,这样测得的滴度才是真正具有参考价值的。

3. 为了您的健康安全,请规范操作,穿戴实验服与手套开展实验。

4. 所有慢病毒操作均需在BSL2级生物安全柜中进行。

5. 本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及治疗。



09/实验案例分析


1. 提前一天使用10 cm细胞培养皿培养ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001),待细胞密度为75% 左右开始包装慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit(LP110-10)进行慢病毒包装。取10 μL慢病毒包装辅助质粒混合物(Package Plasmid Mix)加入到2 mL离心管中,加入2.5 μL表达GFP 的对照质粒(Control Plasmid),轻轻混合,加入32 μL PolyShooter转染试剂与质粒混合,室温孵育3分钟。


3. 往上述混合物中加入1.8 mL无血清无双抗的DMEM基础培养基,轻轻混匀,在室温下静置30分钟,形成转染试剂-核酸复合物。

4. 将上述1.8 mL转染试剂-核酸复合物轻轻地逐滴均匀加入10 cm皿慢病毒包装细胞中,轻轻摇动培养皿混匀,置于37℃,5% CO2培养箱中培养产毒。

5. 转染24 h后,弃去初始病毒上清液,加入10 mL新鲜的*培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中,置于37℃,5% CO2培养箱继续培养。

6. 转染48 h后,收集病毒上清液,再加入10 mL新鲜的*培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中,置于37℃,5% CO2培养箱继续培养。

7. 转染72 h后,观察细胞状态并拍照,进行二次病毒上清液收集,与48 h收集的上清液混合后,300xg离心10分钟以除去细胞碎片,0.22 μm滤器过滤,使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒浓缩试剂盒(LC110R)进行20倍浓缩,使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution(LS110R)重悬慢病毒颗粒。

8. 孔稀释法测定病毒滴度(参考06/实验步骤中病毒滴度测定方法),使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,并拍照记录,实验结果如图2所示。



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