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VirusStars 慢病毒包装细胞系 CL110001的制备方法

发布时间:2022-12-21 点击量:57
  慢病毒载体(Lentiviral vector)较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达siRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达siRNA/miRNA,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
 
  VirusStars 慢病毒包装细胞系 CL110001制备:
 
  细胞:慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293  T,其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因,转染效率高。但其贴壁性不好,所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。多聚赖氨酸培养皿可购买,也可自行制备。转染前,细胞密度控制在40-70%比较好。
 
  DNA:每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞,需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。不同的包膜蛋白表达载体,其使用量也不同。
 
  转染:经济的转染方法是磷酸钙转染法,虽然其溶液配置影响因素多,不易稳定重复得到转染结果。其它方法有脂质体法和PEI法。转染48-60后可以收集上清,通过低速离心,然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。
 
  如果使用VSV-G包膜蛋白的话,可以通过两次超速离心进行浓缩,从而可以获得滴度高达1011-1012IU/ml的慢病毒载体。之后可以将病毒载体溶解在PBS, HBSS或者DMEM中,并置于-800C储存。
 
  储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率,然而有些病毒在侵染细胞时,血清会有干扰,所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。
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