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LeapWal P11110 CCK-8 试剂盒

发布时间:2022/6/18 点击量:84

 

Cell Counting Kit-8

Catalog Number:P11110

 

 

01/产品概述

 

LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110,简称CCK-8或CCK8试剂盒,是一种基于WST-8(水溶性四唑盐,化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒,是MTT、XTT、MTS等的优良替代方法。

  WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(图1)。对于相同起始量的细胞,细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同种细胞,颜色的深浅(生成的formazan量)与细胞数目呈线性关系(图3)。

 

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图1.WST-8检测原理图(EC=electroncouplingreagent,即电子耦合试剂)

 

 WST-8是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有以下明显的优点:

  (1)MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶液来溶解,而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤,WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。

  (2)WST-8比XTT、MTS更加稳定,使实验结果更加可靠。

  (3)WST-8和MTT、XTT等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。

  LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110为即用型试剂,使用方法十分便捷,无须再进行任何配制等操作,无须使用同位素,所有的检测步骤仅在同一块96孔板内即可完成。不必洗涤细胞,不必收集细胞,也不必采用额外的步骤溶解formazan,可以用于大批量样品的检测。同时,WST-8对细胞无明显毒性,加入CCK-8溶液显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,便于找到最佳测定时间。LeapWalCellCountingKit-8CCK-8可以应用于细胞增殖和细胞生长抑制检测、毒性测定、药物筛选、肿瘤药敏等试验。

 

 

02/产品组分

 

截屏2022-06-17 22.27.33.png

03/保存条件

 

冰袋(wetice)运输。4℃避光保存,有效期12个月。-20℃避光保存,有效期24个月。

 

 

04/产品特点

 

  即用型试剂,无须再进行任何试剂的配制

  对细胞无明显毒性,检测时间更加灵活,可在不同时间点反复/连续读值

  显色稳定,使实验结果更加可靠

  线性范围宽,灵敏度高

  可用于大批量样品的检测

 

 

05/实验流程概要

 

cck8 画图_01.png

06/实验步骤

 

一.制作标准曲线(使用此标准曲线的前提条件是试验条件*一致)

  1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液的细胞数量,然后接种细胞;

  2.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般需要做5-7个细胞浓度梯度,每组4-6个复孔;

  3.接种后培养4-6小时使细胞贴壁(悬浮细胞可省略此步骤);

  4.加入LeapWal Cell Counting Kit-8试剂(每100μL培养基加10μLCCK-8)。培养一定时间(0.5-4小时)后测定OD450,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD450为纵坐标的标准曲线,根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。

 

二.细胞活性检测

  1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养16-24小时;

  2.向每孔中加入10μLCCK-8溶液,切勿产生气泡,气泡会影响OD值的读数;

  3.将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时;

  4.用酶标仪测定450nm处的吸光度。

 

三.细胞增殖-毒性检测

  1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养16-24小时;

  2.向培养板加入不同浓度的待测药物(依据实验者具体方案而定);

  3.将培养板置于培养箱内孵育一段时间(依据实验者具体方案而定);

  4.向每孔加入10μLCCK-8溶液,切勿产生气泡,气泡会影响OD值的读数;

  5.将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时;

  6.用酶标仪测定450nm处的吸光度。

  Ø如果待测物质有氧化性或还原性,可在加入CCK-8之前,弃去旧培养基,用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基,来去除药物的影响。当药物影响较小时,也可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白对照孔的吸光度值即可。

 

 

07/计算公式

 

  细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

  抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

  As:实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)

  Ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液,不含药物)

  Ab:空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液,不含细胞、药物)

 

 

08/适用范围

 

  1.细胞增殖测定:CCK-8是水溶性的,在培养基中稳定且无毒。

  2.细胞活性和细胞毒性分析:代谢活性以及染料的形成与细胞的活性和损伤成比例。

  3.细胞因子分析:测定细胞因子诱导的增殖,必要时,可在试验结束时回收和扩增细胞。

 

 

09/注意事项

 

  1.使用96孔板进行检测时,需考虑液体蒸发问题。由于96孔板周围一圈最容易蒸发,建议弃用周围一圈,改加等量的PBS、水或培养液。

  2.细胞增殖实验建议每孔加入100μL2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100μL5000个细胞(具体每孔所用的细胞数目,需根据细胞大小、细胞增殖速度等因素决定)。按照实验需要进行培养并给予0-10μL特定的药物刺激。

  3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,还原剂(例如,抗氧化剂)会干扰检测结果,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。

  4.测试药物如含有金属,对CCK-8显色会有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%,15%,90%的显色反应,使灵敏度降低。如果终浓度是10mM,将会*抑制,需设法去除。

  5.培养基中的酚红不会影响实验结果,酚红的吸光度可以在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

  6.检测时,如果起始培养体积为100μL,每孔加入10μLCCK-8溶液。如果起始培养体积为200μL,则需加入20μLCCK-8溶液,其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测,需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

  7.CCK-8的培养时间一般为0.5-4小时,对于大多数情况孵育1小时即可。孵育时间的长短需根据细胞类型和细胞密度等实验情况而定,需要摸索条件,初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的时间点用于后续实验。

  8.在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片,可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长,例如650nm,作为参考波长进行双波长测定。

  9.酶标仪检测前需确保孔内没有气泡,否则会干扰测定结果。

  10.需要测定细胞的具体数量时,建议同时做标准曲线。

  11.若检测样本较多,建议采用多通道移液器,以减小工作量及平行孔间的差异。

  12.以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板):(a)显色反应后,将培养板放置于4℃冰箱内。(b)每孔加入10μL0.1MHCl溶液。(c)每孔加入10μL1%(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时内测定。

  13.为了您的健康安全,请规范操作,穿戴实验服与手套开展实验。

  14.本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及治疗。

 

 

10/实验案例分析

 

  1.将不同数量的HeLa细胞按照每孔100μL培养液接种于96孔板中,培养24小时后细胞充分贴壁,每孔加入10μLCCK-8溶液。

  2.孵育1小时后测定450nm的吸光度值,检测结果如图3所示。(检测结果仅供参考,实测数据会因检测仪器等的不同而存在差异)

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图3: CCK-8 试剂盒检测细胞活性

 

 


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