Puromycin (10 mg/mL)
Catalog Number：PS610
01/产品概述
Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素。嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3´末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽，从而杀死革兰氏阳性菌、各种动物和昆虫细胞。
Puromycin常用于筛选通过质粒转染、病毒感染、转化等方法能表达pac基因（puror）的真核或原核多克隆或单克隆细胞。pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶 (PAC，Puromycin N-acetyl-tranferase)，赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，从而利用嘌呤霉素筛选特定基因的稳定表达细胞株。Puromycin的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99% 的不表达pac基因的细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。在某些特定情况下，嘌呤霉素也可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
本品是无菌的嘌呤霉素盐酸盐溶液（10 mg/mL），经过滤除菌，可以直接用于细胞培养。
02/产品组分
03/保存条件
冰袋（wet ice）运输。-20℃ 保存，有效期12个月。建议分装保存，避免反复冻融。
04/产品特点
v 即用型试剂，无需进行试剂配置，简单方便。
v 无菌制剂，可直接加入细胞使用。
05/实验步骤
一、Dose-response curve or kill curve嘌呤霉素剂量反应曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒感染为例）
嘌呤霉素的有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株，确定杀死未转染/感染细胞的最小浓度嘌呤霉素非常重要。 对于初次使用的细胞，一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。
1. 提前一天在24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接种细胞，设置剂量梯度及复孔，37℃ 5% CO2细胞培养箱内培养过夜。
2. 次日，将培养过夜后的细胞更换含不同浓度嘌呤霉素的筛选培养基（新鲜配置），
如0、1、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL等浓度梯度，设置至少5个浓度梯度，37℃ 5% CO2细胞培养箱中继续培养。
3. 由于嘌呤霉素可以快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99% 的未表达pac基因的细胞，所以在添加嘌呤霉素后的1-2天就可以观察细胞存活率，从而确定有效杀死正常细胞的药物最小浓度。如果细胞耐药性比较强，需要每日监测细胞，观察存活细胞率，约 2-3 天更换新鲜的筛选培养基，一般4-10天内即可确定嘌呤霉素的最小浓度。
二、建议使用浓度
哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需根据嘌呤霉素剂量反应曲线来确定。
大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125 μg/mL。
Ø 使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，并受宿主细胞本身的影响。
三、哺乳动物稳定表达细胞株的筛选
转染含有pac基因的质粒或者感染含有该基因的病毒后，即可使用嘌呤霉素筛选稳定表达株。
1. 细胞转染或感染48小时后，将细胞置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养，此为处理组。
Ø 当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降，所以细胞的密度最好不超过35%。转染或感染48小时后，如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞，培养过夜后即可进行嘌呤霉素筛选。
Ø 建议同时做一个空白正常细胞的对照组。
2. 每隔2-3天，更换含有嘌呤霉素的培养基。
3. 筛选2-10天后，对照组正常细胞应该100% 死亡，处理组中存活的细胞为表达pac基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。
Ø 应每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要24小时，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2-10天。
4. 待细胞可以稳定生长后，嘌呤霉素的浓度可以减半用于后续的培养。在得到稳定表达细胞株后，一般建议嘌呤霉素也须持续加入，并2-3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液。
06/适用范围
Puromycin普遍应用于稳定细胞株的筛选和维持，也可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
07/注意事项
1. 为了您的健康安全，请规范操作，穿戴实验服与手套开展实验。
2. 本产品对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
3. 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及治疗。
08/实验案例分析
1. 提前一天使用10 cm细胞培养皿培养ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待细胞密度为75% 左右开始包装慢病毒。
2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）进行慢病毒包装，具体步骤参考LP110-10产品说明书。
3. 收集慢病毒上清液，300xg离心10分钟以除去细胞碎片，0.22 μm滤器过滤，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒浓缩试剂盒（LC110R）进行20倍浓缩，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重悬慢病毒颗粒。
4. 提前一天在24孔板中铺Hela细胞，使用上述制备的慢病毒感染目的细胞HeLa。在EP管中做病毒10倍梯度稀释，连续6个稀释梯度。稀释方法如下：准备6个⽆菌EP管，每个EP管中加⼊450μL 新鲜的*培养基（含10 μg/mL polybrene），取待测定病毒液50 μL加⼊到第⼀个EP管中（标记50 μL），混匀后取50 μL病毒稀释液加⼊到第⼆个EP管中（标记5 μL），以此类推，直到稀释到最后⼀管。弃去24孔板中原有的培养基，将稀释好的病毒依次加入孔中，并做好标记，⼩⼼操作，不要吹起细胞，置于培养箱中培养16 h。
5. 慢病毒感染16 h后，吸去带病毒的培养基，在每个孔中再加入 500 μL 预热的新鲜*培养基。
6. 使用含puromycin（5 μg/mL）的筛选培养基进行筛选，对筛选7天后的细胞进行结晶紫染色，并拍照记录，实验结果如图2所示。
09/其他相关产品
