品牌 自营品牌 货号 P09210 供货周期 现货 应用领域 化工,生物产业,农业,制药,综合
PolyShooterTM
Lentivirus Transfection Reagent
01/产品概述
慢病毒是一种逆转录病毒，能使外源基因整合入宿主细胞的基因组，实现外源基因稳定、长期的表达，比一般的逆转录病毒具有更高的滴度和更广的宿主范围。携带外源基因的慢病毒载体与包装载体（产生病毒颗粒所需的辅助蛋白）一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装。包装好的慢病毒为假型病毒（病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，慢病毒中的毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代），分泌到细胞外的培养基中，经过离心取得上清液后进行慢病毒浓缩，浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞后，经过反转录，整合到基因组，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达（下图）。
LeapWal PolyShooter 慢病毒专用转染试剂，PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent，是一种基于阳离子高分子聚合物的新型转染试剂，优化的配方特别适合于慢病毒包装细胞系（293T、293FT等）的病毒包装，具有高效低毒、操作简单、重复性好等优点，能显著提高慢病毒载体在慢病毒包装细胞系中的包装效率，并能产生更多的重组慢病毒，经该转染试剂包装获得的对照质粒病毒滴度可达108 TU/mL，具有感染效率高、感染谱广等特点。此外，PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞造成的损伤。同时，转染后不需要除去转染试剂-核酸复合物或更换新鲜培养基。
02/产品组分
组分 | P09210-01 | P09210-05 |
PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent | 1 mL/支 | 1 mL x 5支 |
03/保存条件
冰袋（wet ice）运输。4℃保存，有效期6个月。-30℃至-10℃保存，有效期12个月，避免反复冻融。
04/产品特点
优秀的慢病毒包装效率——优化的配方特别适合于慢病毒包装细胞系的病毒包装，表现出更好的转染效率和高滴度慢病毒表达水平
细胞毒性低——作用温和，能较好地实现高转染效率与低细胞毒性之间的平衡
操作简单——在血清存在时亦具有可靠的转染效率，转染后无需去除复合物或更换新鲜培养基
具有化学成分明确、无血清、不含动物来源成分等特点，可获得高度重现性和批间可靠性
05/适用范围
LeapWal PolyShooter 慢病毒专用转染试剂优化的配方特别适合于慢病毒包装细胞系（293T、293FT等）的病毒包装，能显著提高慢病毒载体在慢病毒包装细胞系中的包装效率，并能产生更多的重组慢病毒。
06/实验流程概要
（图中所示为包装10cm皿的慢病毒所需试剂量）
07/实验步骤
（以10cm皿包装慢病毒为例，其他培养装置加样体积参考表一：转染量度标准）
1. 细胞准备
转染前一天，将4-6×106 个慢病毒包装细胞（293T、293FT、ViralStarsTM Lentivirus Packaging Cell Line(货号CL110001)等）接种到10 cm细胞培养皿中，使其在包装时密度为70%-80%，放置于37℃，5% CO2培养箱培养16 h～24 h。
Ø 细胞状态会极大影响病毒包装效率，待包装细胞应处于良好生长状态，建议使用生长处于指数期、存活率大于90% 的细胞进行慢病毒包装。
Ø 该转染试剂与ViralStarsTM Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包装出更高滴度、更高表达水平的慢病毒。
2. 慢病毒包装
(1) 取4 μL慢病毒包装辅助质粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL离心管中，加入4 μg含有目的基因的慢病毒载体质粒，轻轻混合，加入20 μL PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent与质粒混合，室温孵育3分钟。
Ø 慢病毒载体质粒需根据研究基因自行构建，应使用无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒提取，保证质粒A260/A280比值为1.8-2.0，浓度不低于500 ng/μL。溶解后的质粒切忌反复冻融，需按照使用量进行分装并于-20℃保存。
(2) 往上述混合物中加入1.8 mL无血清无双抗的DMEM基础培养基，轻轻混匀，在室温下静置30分钟，形成转染试剂-核酸复合物。
Ø 转染试剂-核酸复合物在室温下4个小时内保持稳定。
(3) 将上述1.8 mL转染试剂-核酸复合物轻轻地逐滴均匀加入10 cm皿慢病毒包装细胞中，轻轻摇动培养皿混匀，置于37℃，5% CO2培养箱中培养产毒。
3. 收获病毒
(1) 转染24 h后，可选择弃去初始病毒上清液，加入10-15 mL新鲜的培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养(此步骤可选)。
(2) 转染48 h后，收集病毒上清液，再加入10-15 mL新鲜的培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养。
(3) 转染72 h后，观察细胞状态并拍照，进行二次病毒上清液收集，与48 h收集的上清液混合，300xg离心10分钟以除去细胞碎片，使用0.45 μm滤器过滤，过滤后的上清液可直接感染目的细胞，或使用慢病毒浓缩试剂盒(LC110R)浓缩后感染目的细胞。
Ø 切忌反复冻融病毒，冻融一次病毒滴度将降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年内使用。
表一：转染量度标准
细胞培养装置 | 生长培养基 体积 （mL） | 总质粒量 （μg） | PolyShooterTM Lentivirus 转染试剂 （μL） | 无血清基础培养基体积（μL） |
6孔板 | 2 | 2-4 | 5-10 | 400 |
60 mm培养皿 | 4 | 3-5 | 7.5-12.5 | 800 |
100 mm培养皿 | 10 | 5-10 | 12.5-25 | 1800 |
125 mL摇瓶 | 30-35 | 30-35 | 75-87.5 | 6000 |
500 mL摇瓶 | 120-140 | 120-140 | 300-350 | 24000 |
1000 mL摇瓶 | 240-280 | 240-280 | 600-700 | 48000 |
08/注意事项
1. 核酸质量：想要获得最高的转染效率和更低的细胞毒性，应选用高纯度、无菌、无污染、无内毒素的优质核酸。质粒中的内毒素是转染的大敌，内毒素会导致转染效率显著下降，从而影响慢病毒产量。推荐使用无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒提取，保证质粒A260/A280比值为1.8-2.0。同时，需合理计算质粒用量，转染过量的质粒可能会导致细胞毒性甚至死亡。
2. 包装细胞质量：细胞状态会极大影响转染效率，从而影响慢病毒质量，建议使用生长处于指数期、存活率大于90%的细胞进行慢病毒包装。该转染试剂与ViralStarsTM Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包装出更高滴度、更高表达水平的慢病毒。
3. 细胞密度：建议细胞传代后12-24 h内、细胞密度约为70%-80%时进行慢病毒包装。在实验过程中保证相同的接种条件，确保实验数据的可重复性。
4. 质粒与转染试剂使用比例：转染复合物中DNA (total μg)与PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent (μL) 的推荐比例为1:2.5。想要获得更适合您慢病毒包装体系的转染条件，可以对转染比例在1:1-1:5之间进行优化。
5. PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清基础培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。
6. 所有慢病毒操作均需在生物安全柜中进行。
7. 为了您的健康安全，请规范操作，穿戴实验服与手套开展实验。
8. 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及治疗。
09/实验案例分析
1. 提前一天使用10 cm细胞培养皿培养ViralStarsTM Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待细胞密度为75% 左右开始包装慢病毒。
2. 取4 μL慢病毒包装辅助质粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL离心管中，加入4 μL表达GFP 的对照质粒（Control Plasmid），轻轻混合，加入20 μL PolyShooterTM Lentivirus转染试剂与质粒混合，室温孵育3分钟。
3. 往上述混合物中加入1.8 mL无血清无双抗的DMEM基础培养基，轻轻混匀，在室温下静置30分钟，形成转染试剂-核酸复合物。
4. 将上述1.8 mL转染试剂-核酸复合物轻轻地逐滴均匀加入10 cm皿慢病毒包装细胞中，轻轻摇动培养皿混匀，置于37℃，5% CO2培养箱中培养产毒。
5. 转染24 h后，弃去初始病毒上清液，加入10 mL新鲜的培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养。
6. 转染48 h后，收集病毒上清液，再加入10 mL新鲜的培养基(DMEM +10% FBS)至10 cm细胞培养皿中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养。
7. 转染72 h后，观察细胞状态并拍照，进行二次病毒上清液收集，与48 h收集的上清液混合后，300xg离心10分钟以除去细胞碎片，0.45 μm滤器过滤，使用ViralStarsTM LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒浓缩试剂盒（LC110R）进行20倍浓缩，使用1 mL ViralStarsTM LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重悬慢病毒颗粒。
8. 孔稀释法测定病毒滴度，使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，并拍照记录，实验结果如图2所示。
图2: 使用PolyShooterTM Lentivirus Transfection Reagent包装的慢病毒（GFP）进行滴度检测，采用荧光显微镜检测GFP绿色荧光蛋白表达情况
